PCR实验报告：PCR扩增目的基因

PCR扩增目的基因

王瑞斌1，黄浩哲2

(1. 西南医科大学，2021级口腔20210499120011)

(2. 西南医科大学，2021级口腔20210499120017）

摘要：目的：通过PCR技术对目的基因LDH-B进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳中的扩增产物条带与maker条带进行对比，观察条带位置从而判断目的基因是否扩增成功，熟悉掌握聚合酶链式反应（PCR）实验技术及实验原理，了解PCR扩增引物设计的原理和方法。结果：电泳条带清晰，各条带分明，见少许拖影现象，泳道见一明一暗两条明显条带，较浅条带分子量与目的基因相同。结论：实验成功扩增目的基因，但条带不清晰，二者灰度值差异明显，可能与引物量太多、引物特异性太弱、酶活性降低或PCR程序设计不合理等原因相关。

Abstract: Objective: To amplify the target gene LDH-B by PCR technique, and then compare the amplified product bands with maker bands in agarose gel electrophoresis, observe the position of the bands to determine whether the target gene is amplified successfully, to be familiar with the experimental techniques and principles of polymerase chain reaction (PCR), and to understand the principles and methods of PCR amplification primer design. Results: The electrophoretic bands were clear, each band was distinct, a little trailing phenomenon was seen, two obvious bands were seen in the lane, and the molecular weight of the lighter band was the same as the target gene. Conclusion: The experiment successfully amplified the target gene, but the bands were not clear, and the difference between the two grayscale values was obvious, which might be related to too many primers, too weak primer specificity, reduced enzyme activity or unreasonable PCR program design.

关键词：PCR；目的基因；电泳

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

上游引物：LDH-B F 5'-CGGGATCCAAAATGGCAACTCTTAAGG-3'

下游引物：LDH-B R 5'-GGGGTACCTCACAGGTCTTTTAGGTC-3'

将这两条引物序列送生物技术公司合成引物，收到公司合成的引物后分别用灭菌双蒸水配为10μM引物溶液。

Taq polymerase（天根生化科技有限公司）。

10×TBE电泳缓冲液（pH8.3）：取Tris 108g，Na2EDTA•2H2O 7.44g，硼酸55g置于1L烧杯中，向烧杯中加入约800mL纯水，充分搅拌溶解。用纯水定容至1L后，室温保存。1×TBE电泳缓冲液由10×TBE电泳缓冲液稀释而来（可稀释至0.5×TBE使用），用作配制琼脂糖凝胶和电泳缓冲液。

6×上样缓冲液：称取溴酚蓝（bromophenol blue）50mg，二甲苯青（xylene cyanol FF）50mg，EDTA 0.88g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入40mL纯水，加热搅拌充分溶解；加入36mL甘油（Glycerol）后，使用2N NaOH调pH至7.0；用纯水定容至100mL，室温保存。

10mg/mL EB溶液：戴手套谨慎称取溴化乙锭（ethidium bromide，EB）200 mg 于棕色试剂瓶中，加20mL双蒸水，充分溶解后室温避光保存。EB的工作浓度为 0.5g/mL，也可用10mg/mL EB溶液配制5g/mL的EB染色液。EB是一种致癌物质，操作必须小心。

电泳仪、水平电泳槽、移液器、吸头、1.5mL Eppendorf管（EP管）、一次性手套、锥形瓶、100mL量筒、微波炉、凝胶成像系统、掌式高心机、基因扩增仪

1.2 方法

1.2.1 PCR反应体系的准备

向容积为2.5ml的PE管中依次加入PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer R、Taq polymerase、cDNA template各2.5μl及ddH2O10μl。其中，加入ddH2O时使用量程为10μl的移液枪，其余试剂使用量程为2.5ml的移液枪加入。将PE管瞬时离心10s。

1.2.2 PCR反应程序的设置

将PE管放置于PCR仪后设定如下循环：（1）95℃，30s；（2）60℃，30s（3）72℃，30s。总共循环28次。

1.2.3 琼脂糖凝胶的制备

使用微波炉（中高火）加热琼脂糖（2~3min）至清澈透明的溶液，然后用自来水冲洗冷却至约60℃；将琼脂糖溶液倒入制胶模具中，凝胶厚度约5mm，注意避免产生气泡；凝胶完全凝固后，移去梳子。

1.2.4 加样

PCR结束后，取出样品，加入5μl 6×loading buffer后混匀，瞬时离心，再将10μl混匀样品加入到琼脂糖凝胶样品孔内。将托盘和凝胶放入电泳槽，注意点样端放置于靠近负极。TBE缓冲液恰好没过胶面约1mm。

1.2.5 电泳

调节电压为130V，电流为0.6mA，通电。待条带区分开后关闭电源。

1.2.6 染色

EB染色3min，自来水清洗一次

1.2.7 观察

凝胶成像系统照相保存。

2 结果与讨论

2.1结果

样品在经过染色后呈现出两个清晰的条带，下方的一条较为明显，上方一条较为暗淡。（如图1）

图一 电泳结果

2.2关于实验结果的讨论

2.2.1 琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶的内部空隙均匀一致性是电泳条带整齐均一不出现偏斜的前提，若在制胶时出现未完全溶解就将凝胶倒入平板，会出现凝胶的部分区域空隙大小不一从而导致电泳物质的移动速度不一致，出现条带便宜。琼脂的浓度和电泳带位移速度成负相关。

2.2.2 PCR体系的制备

PCR有固定的反应体系成分，包括PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer R、Taq polymerase、cDNA template等各种成分，还有固定体积，通常用ddH2O配到反应体系，加量需准确无误，并且避免污染。

2.2.3 电泳条带

影响DNA条带扭曲的因素包括电泳缓冲液的种类和浓度、环境温度、凝胶的均一性、琼脂糖的生产质量[1]。也与上样相关，若不小心破坏了凝胶，也会产生条带的扭曲。该实验中下方的条带较上方更明显更亮，二者灰度值差异明显，可能是因为引物量太多、引物特异性太弱、酶活性降低或PCR程序设计不合理等原因，从负极往正极分别为DNA产物及引物二聚体。

2.2.4 PCR引物设计原则

①引物与引物之间不应存在互补序列避免形成稳定的二聚体或发夹结构, 引物与模板的序列要紧密互补。②在选择用来扩增不同物种DNA的引物时, 应避开m RNA的5′和3′末端非翻译区序列。③引物长度以及GC含量合适以保证合适的Tm值。④引物3′端不能选择A, 最好选择T。⑤引物序列在模板内应当没有其他相似性较高的序列。⑥引物5′端可以修饰, 3′端不可修饰且要避开密码子第3位[2]。

3 结论

本实验通过对LDH-B基因的扩增及检测，熟悉并练习了实验的操作过程，对实验中可能存在的问题和需要注意的细节进行了分析，之后对于实验结果进行了思考，分析了实验中各种因素的干扰和影响，锻炼了学生的思考能力，通过课后的文献及资料查询解决问题，既提高了学生的动手能力也同时反思纠错的能力，对于建立良好的科研思考模式有较大帮助。

[1]刘阳,杨淑霞,赖翼,李敏惠,胡松,邹强.影响琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的因素[J].生物学杂志,2009,26(02):70-72.

[2]尤超,赵大球,梁乘榜,周春华引物设计方法综述[J].现代农业科技,2011(17):48-51.